Co je CRISPR?

Technologie CRISPR je jednoduchý, ale výkonný nástroj pro editaci genomů. Umožňuje vědcům snadno měnit sekvence DNA a modifikovat funkci genu. Jeho mnoho potenciálních aplikací zahrnuje opravu genetických defektů, léčbu a prevenci šíření chorob a zlepšení plodin. Její příslib však vyvolává i etické obavy.

V populárním použití je „CRISPR“ (vyslovuje se „ostřejší“) zkratkou pro „CRISPR-Cas9“. CRISPR jsou specializované úseky DNA. Protein Cas9 (nebo „asociovaný s CRISPR“) je enzym, který funguje jako pár molekulárních nůžek, schopný řezat vlákna DNA.

Technologie CRISPR byla přizpůsobena přirozeným obranným mechanismům bakterií a archaea (doména jednobuněčných mikroorganismů). Tyto organismy využívají RNA odvozené od CRISPR a různé proteiny Cas, včetně Cas9, k potlačení útoků virů a jiných cizích těles. Dělají to především tím, že nasekávají a ničí DNA cizího útočníka. Pokud jsou tyto složky přeneseny do jiných, složitějších organismů, umožňuje manipulaci s geny nebo „editaci“.

Až do roku 2017 nikdo nevěděl, jak tento proces vypadá. V příspěvku zveřejněném 10. listopadu 2017 v týmu Nature Communications tým vědců vedený Mikihiro Shibata z Kanazawa University a Hiroshi Nishimasu z Tokijské univerzity ukázal, jak to vypadá, když je CRISPR v akci úplně první čas. [Úchvatný nový GIF ukazuje CRISPR žvýkání DNA]

CRISPR-Cas9: Klíčoví hráči

CRISPR: "CRISPR "znamená" shluky pravidelně interspaced krátkých palindromických opakování. "Jedná se o specializovanou oblast DNA se dvěma odlišnými vlastnostmi: přítomnost nukleotidových repetic a spacerů. Opakované sekvence nukleotidů - stavební bloky DNA - jsou distribuovány v CRISPR. Rozpěrky jsou kousky DNA, které jsou rozptýleny mezi těmito opakovanými sekvencemi.

V případě bakterií jsou spacery odebírány z virů, které dříve napadly organismus. Slouží jako banka vzpomínek, která bakteriím umožňuje rozpoznat viry a potlačit budoucí útoky.

Poprvé to experimentálně demonstroval Rodolphe Barrangou a tým vědců společnosti Danisco, společnosti zabývající se přísadami potravin. V dokumentu z roku 2007 publikovaném v časopise Science vědci použili Streptococcus thermophilus jako jejich model se vyskytují bakterie, které se běžně vyskytují v jogurtech a jiných mléčných kulturách. Zjistili, že po napadení virem byly do oblasti CRISPR začleněny nové spacery. Kromě toho byla DNA sekvence těchto spacerů identická s částmi genomu viru. Také manipulovali s spacery tím, že je vyjmuli nebo vložili nové sekvence virové DNA. Tímto způsobem dokázali změnit odolnost bakterií vůči útoku konkrétního viru. Vědci tak potvrdili, že CRISPR hrají roli při regulaci bakteriální imunity.

CRISPR RNA (crRNA): Jakmile je vložka vložena a virus znovu napadne, část CRISPR je přepsána a zpracována do CRISPR RNA nebo „crRNA“. Nukleotidová sekvence CRISPR působí jako templát k vytvoření komplementární sekvence jednořetězcové RNA. Každá crRNA se skládá z nukleotidové repetice a spacerové části, podle recenze 2014 Jennifer Doudny a Emmanuelle Charpentierové, zveřejněné v časopise Science.

Cas9: Protein Cas9 je enzym, který štěpí cizí DNA.

Protein se obvykle váže na dvě molekuly RNA: crRNA a další nazývanou tracrRNA (nebo „transaktivující crRNA“). Oba pak navádějí Cas9 k cílovému místu, kde provede jeho řez. Tato oblast DNA je komplementární k 20-nukleotidovému úseku crRNA.

Použitím dvou samostatných oblastí nebo „domén“ ve své struktuře Cas9 rozdělí oba řetězce dvojité šroubovice DNA a vytvoří tak, co je známé jako „dvouřetězcová zlom“, v souladu s článkem Science 2014.

K dispozici je vestavěný bezpečnostní mechanismus, který zajišťuje, že se Cas9 neřezává nikde v genomu. Krátké sekvence DNA známé jako PAM („protospacer sousední motivy“) slouží jako značky a sedí vedle cílové DNA sekvence. Pokud komplex Cas9 nevidí PAM vedle své cílové sekvence DNA, nebude se řezat. To je jeden z možných důvodů, proč Cas9 nikdy nenapadl region CRISPR u bakterií, podle recenze z roku 2014 zveřejněné v časopisu Nature Biotechnology.

CRISPR-Cas9 jako nástroj pro úpravu genomu

Genomy různých organismů kódují řadu zpráv a pokynů v jejich sekvencích DNA. Editace genomu zahrnuje změnu těchto sekvencí, a tím změnu zpráv. Toho lze dosáhnout vložením řezu nebo zlomení DNA a oklamáním přirozených mechanismů opravy DNA DNA do zavedení změn, které chce. CRISPR-Cas9 poskytuje prostředky k tomu.

V roce 2012 byly v časopisech Science a PNAS publikovány dva klíčové výzkumné práce, které pomohly transformovat bakteriální CRISPR-Cas9 na jednoduchý programovatelný nástroj pro editaci genomu..

Studie provedené samostatnými skupinami dospěly k závěru, že Cas9 by mohl být nasměrován k odříznutí jakékoli oblasti DNA. Toho lze dosáhnout jednoduše změnou nukleotidové sekvence crRNA, která se váže na komplementární cíl DNA. Ve vědeckém článku z roku 2012 Martin Jinek a jeho kolegové dále zjednodušili systém spojením crRNA a tracrRNA a vytvořili tak jednu „vodící RNA“. Editace genomu tedy vyžaduje pouze dvě složky: orientační RNA a protein Cas9.

"Provozně navrhujete úsek 20 nukleotidových párů bází, které odpovídají genu, který chcete upravit," řekl George Church, profesor genetiky na Harvardské lékařské fakultě. Je konstruována molekula RNA komplementární k těmto 20 párům bází. Církev zdůraznila důležitost zajištění toho, aby nukleotidová sekvence byla nalezena pouze v cílovém genu a nikde jinde v genomu. „Pak RNA a protein [Cas9] nařeže - jako pár nůžek - DNA na tomto místě a ideálně nikde jinde,“ vysvětlil.

Jakmile je DNA rozříznuta, přirozené opravné mechanismy buňky nastoupí a pracují na zavedení mutací nebo jiných změn do genomu. To se může stát dvěma způsoby. Podle projektu Huntington's Outreach Project na Stanfordu (University) zahrnuje jedna metoda opravy slepení obou řezů zpět k sobě. Tato metoda, známá jako „nehomologní spojení konců“, má sklon zavádět chyby. Nukleotidy jsou náhodně vloženy nebo odstraněny, což vede k mutacím, které by mohly narušit gen. Ve druhé metodě je zlom fixován vyplněním mezery sekvencí nukleotidů. Za tímto účelem používá buňka jako šablonu krátký řetězec DNA. Vědci mohou dodat šablonu DNA podle svého výběru, a tak napsat jakýkoli gen, který chtějí, nebo opravit mutaci.

Užitečnost a omezení

CRISPR-Cas9 se v posledních letech stal populárním. Church poznamenává, že tato technologie se snadno používá a je přibližně čtyřikrát účinnější než předchozí nejlepší nástroj pro editaci genomu (nazývaný TALENS)..

V roce 2013 vědci z laboratoří Církve a Feng Zhang z Broad Institute Massachusetts Institute of Technology and Harvard publikovali první zprávy o použití CRISPR-Cas9 k úpravě lidských buněk v experimentálním prostředí. Studie využívající in vitro (laboratorní) a zvířecí modely lidských chorob prokázaly, že tato technologie může být účinná při nápravě genetických defektů. Mezi příklady takových chorob patří cystická fibróza, katarakta a Fanconiho anémie podle článku z roku 2016, který byl publikován v časopise Nature Biotechnology. Tyto studie dláždí cestu terapeutickým aplikacím u lidí.

"Domnívám se, že veřejné vnímání CRISPR je velmi zaměřeno na myšlenku klinického využití genové úpravy k léčbě nemocí," řekl Neville Sanjana z New York Genome Center a docent na biologii, neurovědě a fyziologii na New York University. "To je bezpochyby vzrušující možnost, ale je to jen jeden malý kousek."

Technologie CRISPR se také používala v potravinářském a zemědělském průmyslu k inženýrství probiotických kultur ak očkování průmyslových kultur (například jogurtů) proti virům. Používá se také v plodinách ke zlepšení výnosu, tolerance vůči suchu a nutričních vlastností.

Jednou další potenciální aplikací je vytvoření genových jednotek. Jedná se o genetické systémy, které zvyšují šance na konkrétní vlastnost, která přechází z rodiče na potomka. Nakonec, v průběhu generací, se tato vlastnost rozšířila po celé populaci, podle Wyssova institutu. Genové jednotky mohou pomoci při kontrole šíření nemocí, jako je malárie, tím, že zvyšují sterilitu mezi vektorem nemoci - ženy Anopheles gambiae komáři - podle článku Nature Biotechnology 2016. Podle článku z roku 2014 Kennetha Oyeho a jeho kolegů, zveřejněného v časopise Science, by genové jednotky mohly být také použity k eradikaci invazních druhů a zvrácení rezistence na pesticidy a herbicidy..

CRISPR-Cas9 však nemá své nevýhody.

"Myslím, že největším omezením CRISPR je, že není stoprocentně efektivní," řekl Church. Účinnost úpravy genomu se navíc může lišit. Podle vědeckého článku z roku 2014, který vypracovali Doudna a Charpentier, ve studii provedené na rýži došlo k úpravě genů u téměř 50 procent buněk, které dostaly komplex Cas9-RNA. Zatímco jiné analýzy ukázaly, že v závislosti na cíli může účinnost úprav dosáhnout až 80 procent nebo více.

Existuje také jev „účinků mimo cíl“, kdy je DNA řezána na jiných místech, než je zamýšlený cíl. To může vést k zavedení nezamýšlených mutací. Církev dále poznamenala, že i když se systém omezí na cíl, existuje šance, že nedostaneme přesnou úpravu. Nazval tento „genomový vandalismus“.

Stanovení limitů

Mnoho potenciálních aplikací technologie CRISPR vyvolává otázky o etických výhodách a důsledcích manipulace s genomy.

Ve vědeckém článku z roku 2014 Oye a jeho kolegové poukazují na potenciální ekologický dopad používání genových jednotek. Zavedená vlastnost by se mohla rozšířit za cílovou populaci na další organismy křížením. Genové jednotky by také mohly snížit genetickou rozmanitost cílové populace.

Provádění genetických modifikací na lidských embryích a reprodukčních buňkách, jako jsou spermie a vejce, se nazývá zárodečná linie. Protože změny v těchto buňkách mohou být přeneseny na další generace, použití technologie CRISPR k provedení zárodečných úprav vyvolalo řadu etických obav.

Variabilní účinnost, účinky mimo cíl a nepřesné úpravy představují všechna bezpečnostní rizika. Kromě toho je toho stále mnoho vědecké komunity neznámé. V článku z roku 2015 zveřejněném ve vědě David Baltimore a skupina vědců, etiků a právních odborníků poznamenávají, že zárodečné úpravy zvyšují možnost nezamýšlených důsledků pro budoucí generace “, protože naše znalosti o genetice člověka, interakcích gen-prostředí, a cesty onemocnění (včetně souhry mezi jedním onemocněním a jinými stavy nebo nemocemi u stejného pacienta). "

Další etické obavy jsou více odstupňovány. Měli bychom provést změny, které by mohly zásadním způsobem ovlivnit budoucí generace, aniž bychom k tomu měli souhlas? Co když použití zárodečné úpravy vede z terapeutického nástroje k vylepšení nástroje pro různé lidské vlastnosti?

Za účelem vyřešení těchto obav sestavily Národní akademie věd, techniky a medicíny komplexní zprávu s pokyny a doporučeními pro editaci genomu..

Ačkoli národní akademie naléhají na opatrnost při provádění zárodečných úprav, zdůrazňují „opatrnost neznamená zákaz“. Doporučují, aby byla zárodečná linie provedena pouze na genech, které vedou k závažným onemocněním, a to pouze v případě, že neexistují jiné rozumné alternativy léčby. Mezi jinými kritérii zdůrazňují potřebu mít údaje o zdravotních rizicích a přínosech a potřebu neustálého dohledu během klinických hodnocení. Doporučují také sledování rodin po více generací.

Nedávný výzkum

Kolem CRISPR bylo mnoho nedávných výzkumných projektů. „Tempo objevů základního výzkumu se díky CRISPR rozrostlo,“ řekl biochemik a expert CRISPR Sam Sternberg, vedoucí skupiny v technologickém vývoji v Berkeley, v Kalifornii, která má na starosti Caribou Biosciences Inc., která vyvíjí řešení pro medicínu založenou na CRISPR, zemědělství a biologický výzkum.

Zde jsou některé z nejnovějších zjištění:

• V dubnu 2017 tým vědců zveřejnil výzkum v časopise Science, že naprogramovali molekulu CRISPR, aby našli kmeny virů, jako je Zika, v krevním séru, moči a slinách.
• 2. srpna 2017 vědci v časopise Nature odhalili, že odstranili defekt srdeční choroby u embrya úspěšně pomocí CRISPR.
• 2. ledna 2018 vědci oznámili, že mohou zastavit houby a jiné problémy, které ohrožují výrobu čokolády, pomocí CRISPR, aby byly rostliny odolnější vůči chorobám.
• 16. dubna 2018 vědci upgradovali CRISPR tak, aby upravoval tisíce genů najednou, podle výzkumu publikovaného v časopise BioNews..

Další zpravodajství Alina Bradford, přispěvatelka.

Dodatečné zdroje

• Široký institut: Časová osa klíčové práce na CRISPR
• Genetic Engineering & Biotechnology News: CRISPR-Cas9 Vylepšeno 10000-fold syntetickými nukleotidy
• Broad Institute: Otázky a odpovědi týkající se CRISPR